Амниоцентез у сук

Специалисты тратят много времени и усилий на разработку лучших протоколов разведения собак для получения здорового помета, но информации о состоянии непосредственного окружения плодного яйца в настоя­щее время очень мало. Плодные оболочки окружают тело развивающегося щенка на протяжении всей беременности и, наряду с плацентой, играют ключевую роль в росте и развитии плода (1), поскольку они необходимы для метаболического, газового и гормонального обмена между организмом матери и плода (2). У собак выделяют следующие плодные оболочки: аллантоис, амнион, хорион и желточный мешок (3), образцы околоплодной жидкости у этого вида животных отбирают из амниона и аллантоиса (Рисунок 1).

Рисунок 1. Схема строения плаценты собаки на поздних сроках беременности.

Амниотическая полость обеспечивает физическую защиту развивающегося плода в жидкой среде (4) — амниотической жидкости. Это сложная биологическая жидкость, обеспечивающая механическую и антимикробную защиту плода, а также смазку, питание и поступление факторов роста, имеющих важное значение для нормального развития плода (5). Амниотическая жидкость образуется из секрета ротовой полости, носоглотки, трахеи и легких, а также из выделяемой концептусом мочи (6).

Аллантоическая жидкость у плотоядных видов скапливается внутри аллантоической мембраны, окружающей амнион (7). Аллантоический мешок растет, почти полностью перекрывая хориальный мешок, и сохраняется до родов. Он сообщается с мочевым аппаратом плода и служит резервуаром для продуктов метаболизма плода (4). Первоначальное накопление аллантоической жидкости, вероятно, в основном происходит по механизмам трансмембранного транспорта и секреторной активности из внезародышевых оболочек, а на более поздних сроках беременности — из мезонефроса, метанефроса и почечных секретов (8).

В результате плодную жидкость у собаки можно собрать как из амниотической, так и из аллантоической полостей (Рисунок 2). По изменениям объема и состава этих жидкостей можно оценить метаболический, патологический или онтогенетический статус плода на конкретной стадии беременности (8). Сбор плодной жидкости у суки возможен начиная с середины беременности, поскольку жидкости уже достаточно, а при ультразвуковом исследовании можно различить амниотическую и аллантоическую мембраны (9). Центез проводят иглой через трансабдоминальный доступ и под непрерывным ультразвуковым контролем (10).

Рисунок 2. Нормальная амниотическая (прозрачная) и аллантоическая (желтая) жидкость, полученные с помощью центеза.

Жидкость получают в основном с целью дородовой оценки жизнеспособности и выявления заболеваний плода (11–13). В клинической медицине человека анализ амниотической биологической жидкости широко используется для диагностики хромосомных аномалий или моногенных нарушений, а также для оценки зрелости легких плода, выявления микробной инвазии в амнион, интраамниотического воспаления, инфекций плода и для определения пола плода (14–16).

В ветеринарной медицине раннее выявление аномалий важно для обеспечения благополучия животных и выгодно для заводчика в финансовом плане, поскольку способствует рождению здоровых щенков (и сохранению здоровья суки) и позволяет прервать беременность при неблагоприятном прогнозе. До сих пор плодную жидкость от сук с малым сроком беременности анализировали лишь в нескольких исследованиях (17, 18); в одном исследовании показали возможность определять пол приплода по амниотическим клеткам при одноплодной беременности у собак (19).

Кроме того, пункцию амниотической или аллантоической полостей у собак использовали для исследовательских целей (20, 21), генной терапии и индукции аборта (22). Рассматривают также ее применение в концепции «Единое здравоохранение» (One Health) — учитывая, что собаки и их владельцы живут в одной среде и подвергаются воздействию одних и тех же условий, собаки могут стать хорошей моделью для изучения определенных эффектов окружающей среды, таких как воздействие токсинов (Рисунок 3).

В дальнейшем сбор плодной жидкости будет необходим для создания базы данных для описания амниотической и аллантоической жидкости у здоровых беременных сук; это позволит определить биомаркеры для прогнозирования перинатального исхода.

Рисунок 3. Центез плодной жидкости можно применять с рядом диагностических и исследовательских целей, включая анализ на наличие микроорганизмов, генетическую диагностику, культивирование клеток плода, физический анализ жидкости.

Автор разработал эффективную и доступную методику центрифугирования плодной жидкости у беременных сук во второй половине беременности. Процедуру проводят аналогично применяемой у человека, под контролем ультразвукового исследования (9). До 35-го дня после зачатия объем плодной жидкости в организме суки небольшой, и можно предположить, что потенциальный риск травмирования концептуса выше. Сбор плодной жидкости путем пункции иглой с 35-го дня и до конца беременности считают безопасным (17, 19).

Суке, у которой планируют получать образец плодной жидкости, проводят полное общее и гинекологическое обследование, включая как минимум анализ мочи, анализ крови (развернутый клинический и биохимический) и УЗИ брюшной полости, чтобы оценить исходное состояние здоровья и течение беременности.

Перед получением образца брюшную стенку фиксируют зажимом и дезинфицируют хирургическим скрабом с повидон-йодом и 70%-ным раствором этанола. За 30–60 минут до вмешательства на кожу наносят местный анестетик (лидокаин/прилокаин) в дозировке не более 0,4 мл/кг на область введения иглы. Затем на обработанную кожу до начала сбора материала накладывают липкий пластырь (23).

Существует два варианта получения образцов, в обоих используют одноразовую спинальную иглу (калибра 18–21G x 3½ дюйма / 9 см).

Методика пункции вслепую

Этот метод проводят без наведения иглы. Сначала беременную матку и гестационный мешок, а также плод исследуют ультразвуковым методом и выбирают оптимальное место для получения жидкости без травмирования плода или плодных оболочек. Одновременно оценивают расположение плода (в левом или правом роге матки) и место сбора жидкости (аллантоис или амни­он). Затем под углом почти 90 ° через брюшную стенку вводят спинальную иглу и продвигают ее сначала в полость матки, а затем в гестационный мешок (амнион или аллантоис).

На скане часто видны амниотическая и аллантоисовая оболочки, но не всегда удается точно определить положение кончика иглы (Рисунок 4).

Рисунок 4. Проведение центеза по методике пункции вслепую.

После введения иглы жидкость аспирируют шприцем объемом 3 или 5 мл, немедленно переносят в стерильную пробирку и замораживают при температуре -20 °C или -80 °C для последую­щего анализа.

Методика пункции с наведением иглы

Метод предполагает использование направляющей иглы, которую можно прикрепить к конвексному ультразвуковому датчику. Перед получением образца направляющую стерилизуют в автоклаве и (при получении у одной суки нескольких образцов) между получением образцов из каждого гестационного мешка дезинфицируют 70%-ным этанолом. Направляющую прикрепляют к зонду согласно инструкциям производителя, а спинальную иглу вводят через небольшое отверстие в заранее установленном месте на направляющей (Рисунок 5). Введение в плодные оболочки, получение жидкости и ее обработку осуществляют по процедуре, описанной для методики пункции вслепую.

Рисунок 5. Проведение центеза с использованием направляющей под контролем ультразвукового исследования.

Использовать направляющую может быть безопаснее и проще менее опытным операторам, а основным недостатком этого подхода является необходимость стерилизовать аппарат между получением образцов плодной жидкости из разных концептусов у одной суки во время процедуры. По мере накопления опыта операторы начинают предпочитать методику пункции вслепую. Из каждого плода удается извлекать, в зависимости от размеров суки, дня беременности и положения плода, в пределах 0,5–5,0 мл жидкости.

Перед извлечением спинномозговой пункционной иглы извлеченный объем жидкости следует заменить равным объемом стерильного 0,9%-ного раствора хлорида натрия. После получения образца суку следует выдержать в спокойной обстановке не менее 24 часов, чтобы предотвратить возможные кратковременные осложнения.

У человека потенциальными осложнениями амниоцентеза считают инфекцию амниотического мешка, индукцию преждевременных родов, нарушение дыхания у матери, деформацию плода, аллоиммунизацию, незаживление пункционной раны (24).

Хотя в медицине человека повреждение плода происходит очень редко, оно может развиться вторично в результате травмирования иглой. На сегодняшний день автор не обнаружил ни одного случая макроскопического повреждения плода после проведения центеза у сук, хотя микроскопические повреждения возможны — не исключено, что некоторые микроскопические участки проколов матки, плодных оболочек или самого плода остались незамеченными, а если они и имели место, то не имели клинического значения (9).

Хотя методы сбора плодной жидкости у суки все еще находятся в зачаточном состоянии, этот метод может уже в ближайшие годы обеспечить ветеринарным врачам, заводчикам и владельцам мелких животных ряд преимуществ. Для опытного врача сбор аллантоической или амниотической жидкости не составит больших трудностей, а риск для плода при этом минимальный. Анализ жидкости способствует раннему выявлению аномалий и генных нарушений, дефектов плаценты, микробной инфекции суки или плода, а также в определении пола.