Часто задаваемые вопросы по гематологии у собак

Для верной интерпретации данных общего клинического анализа крови в ветеринарной клинике результаты должны отражать реальное состояние пациента, чтобы помочь наравне с другими инструментами установить точный диагноз и назначить соответствующее лечение.

Качественные и надежные результаты при гематологическом анализе можно получить, только учитывая ряд важных аспектов, о которых следует знать. К ним относятся уровень контроля качества в гематологическом анализаторе, выявление возможных источников ошибок (преаналитических, аналитических и постаналитических), а также необходимость просмотра мазков крови. Цель этой статьи, написанной в формате «вопрос — ответ», — рассмотреть наиболее распространенные «подводные камни», возникающие при проведении гематологических исследований у собак и интерпретации их результатов.

Липемия (Рисунок 1) увеличивает мутность образца и препятствует измерению концентрации гемоглобина. Кроме того, в зависимости от операционной системы анализатора (импеданс или лазерный луч), микрокапли липидов могут привести к ошибочному увеличению количества тромбоцитов, средней концентрации гемоглобина в эритроцитах (mean corpuscular hemoglobin concentration — MCHC) и общего количества лейкоцитов (1, 2).

Одна из наиболее частых причин липемии — недостаточное количество времени после приема пищи; чтобы уменьшить или устранить это влияние, кровь следует сдавать только после голодания в течение 12 часов. 

Рисунок 1.  Диаграмма рассеяния, полученная с помощью анализатора SysmexTM XN, показывает влияние липемии (стрелка) на дифференциацию лейкоцитов (white cell differential — WDF) (a) и количество лейкоцитов и ядросодержащих эритроцитов (WNR) (b). Обратите внимание, как липемия препятствует правильному отличию нейтрофилов от ядросодержащих эритроцитов в канале WDF, а также эритроцитов и лейкоцитов в канале WNR.  (SFL = боковое флюоресцентное освещение, SSL = боковое рассеянное освещение, FSL = прямое рассеянное освещение).

Гематологические анализаторы с лазерным лучом измеряют количество эритроцитов, концентрацию гемоглобина (как внутриклеточного, так и свободного гемоглобина в плазме) и средний объем эритроцита (mean corpuscular volume — MCV). Если образец подвергся гемолизу, уровень MCHC может быть повышен, а количество эритроцитов и гематокрит обычно оказываются ниже нормы (3).

MCHC — один из важнейших параметров эритроцитов, поскольку значения выше референсных указывают на ошибки измерения или артефакты цвета плазмы (гемолиз, липемия) или на морфологические изменения эритроцитов (наличие сфероцитов, эксцентроцитов или телец Хайнца). Поэтому во всех случаях повышения уровня MCHC необходимо оценивать образец плазмы и морфологию эритроцитов (Рисунок 2).

Рисунок 2.  Мазок крови собаки с отравлением луком; наблюдается образование эксцентроцитов (стрелки) 

Да, незнание особенностей породы может вызвать проблемы. Например, у кавалер-кинг-чарльз-спаниелей имеется физиологическая макротромбоцитопения (обусловленная мутацией в гене бета-1 тубулина) (6).

Анализаторы обнаруживают эти макротромбоциты при расчете тромбокрита (объема, занимаемого тромбоцитами в крови); это важно, поскольку данный показатель отражает необходимый адекватный уровень тромбоцитов лучше, чем абсолютное количество тромбоцитов (7). При подозрении на мутацию для окончательного подтверждения диагноза требуется молекулярное исследование.

Можно привести много других примеров. У некоторых восточных пород (например, акита, шар-пей и сиба-ину) могут наблюдаться физиологический микроцитоз (размер эритроцитов меньше нормы) и более низкий уровень гемоглобина в ретикулоцитах, чем у собак других пород (8).

У пуделей средний объем эритроцитов обычно выше, чем у собак других пород. У грейхаундов, как и у других борзых, по сравнению с другими породами обычно более высокие гематокрит, количество эритроцитов и концентрация гемоглобина, а количество тромбоцитов более низкое и имеется легкая лейкопения (9).

Поэтому при интерпретации результатов исследования животного всегда необходимо учитывать нормальные референсные диапазоны для его вида, возраста и породы. Важно знать различия для пород собак, регулярно встречающихся в вашей клинике.

Гематологический анализ у собак проводят с цельной кровью, обработанной антикоагулянтом ЭДТА, но в ветеринарии также используют другие антикоагулянты, такие как гепарин или цитрат, и неправильное применение антикоагулянтов может привести к неточным результатам. Гепаринизированную цельную кровь не следует использовать для подсчета клеток, поскольку в таких образцах часто происходит агрегация тромбоцитов и лейкоцитов.

Гепарин в качестве антикоагулянта применяют, чтобы получить плазму для биохимических анализов, а цельную кровь с цитратом в основном используют для анализа свертываемости крови, а также для получения плазмы или проведения исследований вязкоэластичности крови.

Однако описано использование цитрата в образцах крови для подсчета клеток, если в образцах крови с ЭДТА наблюдается агрегация тромбоцитов и/или лейкоцитов. При использовании в такой ситуации пробирок с цитратом (содержащих 3,2% жидкого цитрата натрия) соотношение цитрата и крови должно составлять строго 1:9. Это приводит к незначительной гемодилюции в образцах цитратной крови, которую должен учитывать врач при анализе результатов, полученных от гематологического анализатора (10).

ЭДТА — антикоагулянт выбора для гематологических исследований. В медицине человека рекомендуют получать в пробирку образец крови в объеме, не более чем на 10% отличающемся от объема, рекомендованного производителем. Недостаточный или избыточный объем образца может снизить точность результатов гематологического анализа.

При работе с собственным гематологическим анализатором важно участвовать в программах контроля качества. Американское общество ветеринарной клинической патологии (American Society of Veterinary Clinical Pathology — ASVCP) опубликовало ряд руководств для улучшения контроля качества в ветеринарной гематологии (11–14) и внедрения улучшений для предотвращения преаналитических, аналитических и постаналитических ошибок.

Необходимо выполнять внутренние программы контроля качества с использованием контрольных образцов и дополнительно участвовать во внешних, региональных и/или международных программах контроля качества.

Чтобы сократить количество образцов, для которых необходимо определять микрогематокрит вручную, рекомендуется изучить взаимосвязь концентрации гемоглобина cо значением гематокрита. В целом применяется «правило трех»: значение гематокрита должно быть примерно в 3 раза выше концентрации гемоглобина. Если значение гематокрита выходит за пределы этого диапазона, следует вручную измерить микрогематокрит и включить в анализ результат измерения вместе со значениями MCV и MCHC (10).

Стоит также отметить, что на значение гематокрита, полученное с помощью автоматического анализатора, может повлиять гипернатриемия. Эритроциты животного с гипернатриемией могут набухать при смешивании с разбавителем в анализаторе, что приводит к ложному увеличению MCV и, следовательно, гематокрита (17). 

ASVCP разработало рекомендации по микроскопическому исследованию мазков крови и подтверждению данных автоматизированного подсчета лейкоцитарной формулы (14). Подход ветеринарных экспертов к просмотру мазков крови разнится: некоторые рекомендуют проверять все образцы с микроскопией мазка вручную, а другие считают, что микроскопия мазков и/или подсчет лейкоцитарной формулы вручную требуются только при выявлении определенных специфичных критериев.

Применимость каждого из подходов зависит от популяции пациентов и клинической ситуации (например, больные пациенты, обследование перед анестезией или гериатрические пациенты), типа гематологического анализатора и базы знаний персонала лаборатории.

Гематологические анализаторы с лазерным лучом, помимо численных значений, предоставляют результаты в графическом виде (цитограммы). В различных ветеринарных исследованиях было показано, что цитограммы очень полезны для принятия решения об исследовании мазков крови (18, 19).

Учитывая эту информацию, разумно рекомендовать исследование мазка крови в следующих случаях:

1. получена аномальная цитограмма;

2. анализатор сигнализирует о возможном сбое или ошибке в классификации лейкоцитов;

3. количество лейкоцитов находится за пределами референсного диапазона.

Автоматические анализаторы лазерного луча могут выявить токсические изменения нейтрофилов или сдвиг лейкоцитарной формулы влево (Рисунок 4). Однако данных о чувствительности и специфичности этого метода очень мало, поэтому у больных животных или животных с лейкоцитозом либо если анализатор выдает предупреждение (Рисунок 5), важно всегда проводить микроскопию мазка крови.

Рисунок 5. Хотя автоматизированные анализаторы могут давать крайне важную информацию о гематологическом статусе животного, у всех пациентов с тяжелым течением заболевания также следует проводить микроскопию мазка крови

Рисунок 4. Скатерграммы распределения лейкоцитарной формулы у двух собак, полученные с помощью анализатора SysmexTM XN; здоровая собака (а) по сравнению с собакой с лейкоцитозом и сдвигом формулы влево (b). Обратите внимание на изменения локализации и распределения популяции нейтрофилов у второй собаки по сравнению со здоровой собакой, а также на слабое разделение лимфоцитов и нейтрофилов. Такой результат служит предупреждением для врача о необходимости провести микроскопию мазка крови вручную. (SFL = боковое флуоресцентное освещение, SSL = боковое рассеянное освещение).

Это связано с тем, что в анализаторах с лазерным лучом используют флуоресцентный полиметиновый краситель, окрашивающий также паразитов внутри эритроцитов (21, 22).

Однако такое явление происходит редко и чувствительность этих анализаторов для выявления кровепаразитов неизвестна, поэтому в настоящее время рекомендуется исследовать мазок крови при любых подозрениях или рутинно у животных из районов, эндемичных по бабезиозу или другим трансмиссивным заболеваниям (23, 24).

Рисунок 6. Макроскопическая (а) и микроскопическая (b) картина аутоагглютинации у собаки с иммуноопосредованной гемолитической анемией.

Во всех случаях обнаружения сниженного количества тромбоцитов рекомендуется провести исследование мазка крови — отчасти из-за рисков возникновения артефактов вследствие транспортировки или нарушений при взятии крови, которые часто встречаются в ветеринарной медицине. Количество тромбоцитов можно оценить по мазку крови, умножив среднее количество тромбоцитов в поле зрения при тысячекратном увеличении (масляная иммерсия) × 15000/мкл.

Однако в одном исследовании при использовании этого метода у собак были выявлены очень высокая вариабельность расчетного количества тромбоцитов и зависимость от оператора, проводящего анализ, и оцениваемого участка мазка (25).

Недостаточная надежность определения количества тромбоцитов в любых образцах с агрегатами тромбоцитов делает это исследование бесполезным и позволяет считать его ненужным для большинства гематологических образцов.

Согласно клиническим рекомендациям, если количество тромбоцитов находится в пределах референсного диапазона, агрегация тромбоцитов является клинически незначимой. Однако всякий раз, когда автоматический подсчет указывает на тромбоцитопению, следует проводить микроскопический анализ мазка крови для оценки агрегации тромбоцитов (Рисунок 8) (26).

Рисунок 8. Мазок крови собаки; присутствуют паразиты Babesia canis

В последние годы произошло значительное развитие ветеринарной гематологии, особенно благодаря внедрению более технологичных анализаторов. Однако практикующему ветеринарному врачу необходимо знать, что множество факторов могут привести к вводящим в заблуждение результатам; для надежной диагностики крайне важны правильный отбор и хранение материала, а также регулярные и соответствующие требованиям про­цедуры контроля качества собственных анализаторов.

Для более точной диагностики заболеваний наших питомцев во многих случаях по-прежнему необходимо ручное исследование мазков крови!