Жидкостная биопсия — будущее диагностики рака?

Метод клеточных блоков

Жидкий образец можно преобразовать в фиксированный формалином клеточный блок несколькими методами. К ним относятся добавление к образцам геля HistoGelTM (15), хирургического гель-пены (16) или агарозы (17), а также заливание фиксированных формалином жидких образцов в парафин (18, 19). У этого метода есть несколько преимуществ по сравнению с традиционной цитологией, в том числе сохранение архитектуры клеточных кластеров, возможность применения иммуногистохимии или других методов, а также сохранение образцов. Однако интервал времени между постановкой первичного диагноза и началом терапии при использовании этого метода больше, чем при использовании традиционной цитологии или других методов жидкостной биопсии.

Один из способов подготовки клеточного блока – метод формирования клеточных блоков в трубке (Cell Tube Block, CTB) – обладает хорошим потенциалом для широкого применения и может быть легко применен с использованием простых материалов и оборудования (Рисунок 1). Если вкратце, он заключается в том, что простую капиллярную трубку заполняют жидким образцом и подвергают центрифугированию. Затем трубку разрушают на границе раздела между жидкой и твердой фазами, после чего фиксируют в формалине в течение 24 часов. После фиксированные формалином клеточные блоки заливают в парафин, после чего они могут обрабатываться различными красителями или иммуногистохимическими методами (20).

Этот метод основан на том факте, что центрифугирование вызывает формирование в капиллярной трубке клеточных слоев с с концентрацией неопластических клеток, зажатых между эритроцитами внизу и нейтрофилами, макрофагами и мезотелиальными клетками на границе раздела жидкости и твердого вещества. Отсутствие воспалительных клеток или эритроцитов среди популяции неопластических клеток дает ослабление фонового окрашивания при иммуногистохимическом исследовании (21). Следует обратить внимание, что этот способ выделения неопластических клеток также может облегчить их молекулярное исследование.

PARR

Метод полимеразной цепной реакции для анализа перегруппировки рецепторов антигена (PARR) в настоящее время используется для диагностики лимфомы или лейкоза по образцам с сомнительной цитологической или гистологической морфологией. Он также может быть использован для фенотипирования лимфомы – определения, к какой форме она относится: B-клеточной или Т-клеточной (прогнозы для этих двух форм различаются). Этот метод ПЦР используется для оценки клональности лимфоцитов путем оценки длины генов иммуноглобулина в В-клетках или генов-рецепторов Т-клеток в Т-клетках (21). Хотя чувствительность и специфичность этого метода анализа варьируются в зависимости от лаборатории, PARR способен обнаруживать неопластические клетки в концентрации 1:100 (21). Инфекционные заболевания (например, инфицирование Ehrlichia spp.) также могут приводить к возникновению клональной популяции лимфоцитов (21) и снижать специфичность PARR. В недавнем исследовании с участием 271 пациента чувствительность и специфичность PARR при диагностике лимфомы собак составили соответственно 86,5 и 98,7 % (22).

Этот метод включает в себя выделение ДНК из неопластических клеток, полученных из образца крови либо образца, взятого для цитологического или гистологического исследования. Затем выполняется ПЦР с использованием праймеров для амплификации вариабельного участка (V-области) генов рецептора Т-клеток или иммуноглобулина. Продукты ПЦР разделяются по размеру (это может быть сделано разными методами); обнаружение одноразмерных продуктов ПЦР предполагает их клональность, тогда как обнаружение разнообразных продуктов ПЦР подтверждает реактивный процесс.

Проточная цитометрия

Проточная цитометрия представляет собой еще один метод молекулярного анализа, который можно применить для диагностики и иммунофенотипирования лимфомы или лейкемии с использованием жидких образцов, полученных из крови, из выпота либо с помощью тонкоигольной аспирации, вводимых в питательные среды для культивирования клеток. В отличие от PARR, для проведения проточной цитометрии требуется наличие суспензии клеток; цитологические препараты или фиксированные формалином образцы, залитые в парафин, для этого метода не подходят. Этот метод анализа основан на использовании специфических длин волн света для возбуждения конъюгированных с флуорофором антител/белков. В сочетании со сложным оборудованием для визуализации, способным обнаруживать вспышки флуоресценции, метод позволяет определять различные характеристики клеток. Для оценки экспрессии клеточной поверхности белка клетки окрашивают антителами, конъюгированными с флуоресцентными белками. Сортировка клеток производится по их относительной флуоресценции. Хотя некоторые белки (например, CD45) экспрессируются на поверхности всех лимфоидных клеток, другие обычно ограничиваются субпопуляциями Т-клеток (например, CD3) и В-клеток (например, CD79a, CD20). Использование этих более специфичных реагентов позволяет определить процент каждого подтипа в популяции клеток.

В одном исследовании сравнивалась эффективность применения PARR и проточной цитометрии для диагностики лимфомы, а также для определения иммунофенотипа, уже определенного при иммуногистохимическом исследовании биопсий увеличенных лимфатических узлов (23). И PARR, и проточная цитометрия в этом исследовании продемонстрировали специфичность 100 %, однако у проточной цитометрии оказалась более высокая чувствительность, чем у PARR (98 % по сравнению с 74%). Это исследование показывает, что проточная цитометрия может оказаться более эффективным методом диагностики лимфомы в увеличенных лимфатических узлах, чем PARR, но поскольку для проточной цитометрии требуются свежие образцы, PARR очевидно предпочтителен при исследовании образцов, не подходящих для проточной цитометрии.

Метод CADETSM на ГЦЗН

Метод CADETSM на ГЦЗН представляет собой новый молекулярный тест, позволяющий отличить гистиоцитарные злокачественные новообразования (ГЦЗН) от других сходных круглоклеточных новообразований. Некоторые исследования показали, что до 70% случаев, первоначально поставленного диагноза ГЦЗН могут быть определены неверно (24, 25). Отличить ГЦЗН от плазмоцитомы может быть особенно сложно, в обычных цитологических препаратах же сложности возникают с дифференцированием ГЦЗН от лимфомы. Для анализа могут использоваться небольшие образцы, обогащенные опухолевыми клетками, например, экссудат или тонкоигольные аспираты. Также этот метод позволяет работать с гистологическими образцами. При анализе определяется количество копий определенной последовательности ДНК, которые присутствуют в опухолевых клетках при ГЦЗН. Сокращение количества присутствующих копий соответствует диагнозу ГЦЗН.

Этот метод проверен на более чем 500 уникальных онкологических образцах, подтвержденных патологическим исследованием, с ГЦЗН и несколькими другими типами новообразований, сходных с ГЦЗН, включая лимфому, плазмоцитому, гемангиосаркому, беспигментную меланому и мастоцитому. Результаты показывают, что эта генетическая «подпись» является высокочувствительным и точным маркером, позволяющим отличить ГЦЗН собак от других типов новообразований с чувствительностью 78% и специфичностью 95%.

Как сейчас диагностируется ПКК/УК?

В настоящее время самый распространенный вариант диагностики ПКК/УК – тот, при котором собака с признаками заболевания нижних мочевыводящих путей сначала получает несколько повторных курсов противомикробных препаратов, а иногда и нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП), исходя из предположения, что причина заболевания – доброкачественная. Такой подход приводит к потере нескольких месяцев, в течение которых ПКК/УК может перерасти в более позднюю стадию, стать крупнее, врасти в мышечную стенку, а также с большими шансами дать метастазы. Если повторный курс лечения не приводит к исчезновению клинических признаков, собака обследуется на наличие ПКК/УК, обычно методом цитологического исследования мочи, абдоминального ультразвукового исследования и/или цистоскопии.

При обнаружении новообразования рекомендуется сделать его биопсию с целью гистопатологической оценки, которая может подтвердить диагноз ПКК/УК, а также указать на наличие или отсутствие врастания в мышцы.

В дальнейшем для оценки региональных лимфатических узлов применяются различные методы визуальной диагностики. На момент постановки диагноза у более 90 % собак обнаруживается частичное или полное врастание ПКК/УК, а у около 20% опухоль успевает распространиться и на другие органы (6, 7). Значительное превалирование опухолей, обнаруживаемых на поздних стадиях развития, может отражать длительность времени, которое в большинстве случаев требуется для постановки диагноза.

Какие методы лечения ПКК/УК используются в настоящее время?

После постановки окончательного диагноза ПКК/УК собаке назначается лечение; чаще всего оно включает в себя использование химиотерапии. При терапии одним препаратом, доля собак, выходящих в ремиссию, обычно низка (< 20 %), хотя она увеличивается до 35–50 % при комбинированной химиотерапии в сочетании с ингибиторами циклооксигеназы. У собак, получавших монопрепаратную терапию НПВП, среднее время выживания составляет около 6–7 месяцев, тогда как комбинация цитотоксической химиотерапии (обычно митоксантрона) и НПВП позволяет добиться среднего времени выживания около 10 месяцев. Хирургическое вмешательство и лучевая терапия также используются, хотя и реже, чем медикаментозное лечение. Недавно полученные данные свидетельствуют о том, что добавление полного курса лучевой терапии с модулированием пучка и под контролем визуальных методов дает около 60% положительных клинических ответов и увеличивает среднее время выживания до >21 месяца (8).

В чем заключаются сложности диагностики ПКК/УК?

Диагноз ПКК/УК у собак устанавливается по обнаружению аномальных эпителиальных клеток в осадке мочи или в образцах, полученных путем травматической катетеризации, промывания предстательной железы и/или тонкоигольной аспирации (9). Однако результат цитологического исследования эпителиальных клеток может привести к постановке неверного диагноза. Например, доброкачественные эпителиальные клетки могут быть похожи на злокачественные клетки с измененными размерами (10).

При тонкоигольной аспирации опухолевой ткани существует риск распространения опухолевых клеток по ходу иглы (11). В настоящее время для клинической диагностики ПКК/УК у собак требуется комплексное диагностическое обследование, в которое входит полный анализ крови, биохимический анализ сыворотки крови, анализ мочи, методы визульной диагностики, исследование опухолевых клеток клиническим патоморфологом и гистопатологическое исследование образца биопсии.

Так как большинство случаев ПКК/УК диагностируются лишь на поздней клинической стадии, для этого заболевания характерен сомнительный или неблагоприятный прогноз. Обнаружение опухоли на более ранней стадии позволяет раньше начать соответствующее лечение, поэтому ранняя диагностика улучшит качество жизни и продлит время выживания. Опрос, проведенный среди 400 стажеров и дипломированных специалистов Американского колледжа ветеринарной медицины, о том, чего им не хватает в практике, показал, что ветеринарным врачам не хватает в том числе надежного неинвазивного диагностического теста для выявления ПКК/УК у собак (материал готовится к публикации).

Каковы новые возможности раннего выявления ПКК/УК у собак?

В двух недавних независимых исследованиях, проведенных исследовательскими группами в NCSU (12) и Национальном центре здравоохранения (NIH) (13), в образцах биопсии, взятых у собак с ПКК/УК, подтвержденных патологическим исследованием, была обнаружена одиночная мутация в экзоне 15 гена B-Raf. Эта одиночная мутация приводит к замене в опухолевых клетках одной аминокислоты (валина на глутаминовую кислоту) в белке B-Raf. Эта замена, расположенная в активационном сегменте киназного домена этого гена, приводит к синтезу мутантного белка с повышенной киназной активностью, запускающего пролиферацию клеток, что и приводит к развитию опухоли. Мутация B-Raf не обнаруживается в неопухолевых тканях мочевого пузыря, в том числе при воспалениях мочевого пузыря и полипах (12). Если у собаки возникает ПКК/УК, клетки опухолевой массы, начиная с самой ранней стадии заболевания, отслаиваются и попадают в мочу (Рисунок 2). Рабочей группой NCSU был создан быстрый и высокочувствительный тест, позволяющий обнаружить наличие этой мутации в клетках (14), а его доработка, в свою очередь, привела к созданию первого в мире коммерчески доступного метода жидкостной биопсии для диагностики рака у животных – тест CADETSM на присутствие мутаций B-Raf*, показанного на Рисунке 3.